Sequenziamento del DNA
Che cos'è il sequenziamento del DNA?
Il sequenziamento del DNA è una procedura che permette di stabilire l'esatta composizione della sequenza di nucleotidi che forma un filamento di DNA.
La possibilità di effettuare questo tipo di analisi è di grande aiuto in numerosi campi di applicazione della biologia, come la determinazione delle sequenze responsabili delle malattie genetiche nell'uomo e la possibilità di individuare l'identità di un individuo attraverso il suo DNA, con tutte le applicazioni di tipo legale che questa possibilità permette.
In campo ecologico, la capacità di sequenziare il genoma di interi organismi o di frazioni particolarmente significative ha permesso l'inizio di una nuova era dello studio della sistematica dei viventi, che utilizza le similitudini o le differenze nelle sequenze di DNA tra i vari organismi per stabilirne i rapporti filogenetici. Forse il settore che ha maggiormente giovato di queste tecniche, nell'ambito della ricerca di base, è quello della microbiologia.
Un gran numero di microrganismi, infatti, non sono adatti ad essere mantenuti in coltura con le tecniche attualmente disponibili e pertanto se ne ignorava l'esistenza. La possibilità di analizzare il contenuto microbico di campioni ambientali mediante amplificazione e analisi del DNA in esso contenuto ha rivelato l'esistenza di un numero inimmaginabile di specie batteriche mai rivelate prima.
Lo sviluppo delle tecniche di sequenziamento del DNA ha fatto passi da gigante, dalla comparsa delle tecniche di tipo chimico, avvenuta per mano di Maxam e Gilbert, all'avvento delle più efficienti tecniche di tipo enzimatico che hanno portato allo sviluppo di sistemi automatici molto rapidi e a bassissimo costo che hanno rivoluzionato il settore negli ultimi anni.
Sequenziamento del DNA: tecniche chimiche
La tecnica si sequenziamento con metodologia chimica, che prende il nome dagli scienziati che la misero a punto e che per questo furono o insigniti del premio Nobel per la chimica, prevede l'utilizzo di marcatori chimici radioattivi che legano le estremità 3' dei filamenti.
Per analizzare la sequenza, il filamento viene inizialmente tagliato ed i frammenti separati in 4 aliquote di miscela ognuna contenente una porzione uguale di acido nucleico. Le quattro aliquote sono poi trattate separatamente con molecole in grado di tagliare i filamenti in corrispondenza di specifiche basi e le estremità 3' di ogni piccolo frammento prodotto sono marcate radioattivamente utilizzando l'elemento 32P.
Le miscele trattate vengono poi fatte correre in elettroforesi in modo da poter determinare la lunghezza di ogni frammento di cui si conosce l'identità delle basi alle due estremità. Il confronto tra tutte le informazioni ottenute permette di ricostruire l'intera sequenza.
Il metodo chimico descritto da Maxam e Gilbert è stato il primo sistema di sequenziamento del DNA conosciuto e per questo ha rappresentato una pietra miliare per la biotecnologia moderna; tuttavia presentava molti limiti, essendo lungo, laborioso e molto costoso. Per queste ragioni mal si prestava ad essere utilizzato su larga scala o per affrontare sfide impegnative come il sequenziamento del genoma umano. Per accedere a queste conoscenze si dovette attendere lo sviluppo delle tecniche enzimatiche di tipo automatizzato.
Sequenziamento del DNA: tecniche enzimatiche
L'approccio enzimatico, ideato da Sanger e che da lui prende il nome, non prevede la marcatura delle sequenze già presenti, ma la ricostruzione di un nuovo filamento, a partire dal filamento stampo da sequenziare, utilizzando nucleotidi marcati e capaci di interrompere la reazione di polimerizzazione.
Il processo richiede quindi la presenza di un filamento stampo, di un primer di RNA per avviare la sintesi del nuovo filamento e di una miscela di nucleotidi. Tale miscela comprende una piccola parte di nucleotidi modificati, detti ddNTPs, ossia dideossinucleotidi, mancanti del gruppo ossidrile in posizione 3'.
La mancanza del gruppo ossidrile fa si che, una volta incorporati nella sequenza del filamento neoformato, la DNA polimerasi si blocchi e non sia in grado di proseguire nella sintesi. Questo comporta la formazione di un frammento parziale di DNA, che si interrompe in corrispondenza di una base nota marcata chimicamente con sostanze fluorescenti. I frammenti così prodotti vengono fatti correre su gel di poliacrilammide e se ne determina la lunghezza, potendo così ricostruire la sequenza di partenza.
A partire dalla tecnica di Sanger si sono evoluti sistemi di automatizzazione in cui ogni base è marcata con sostanze a diversa fluorescenza e un unica elettroforesi è in grado di determinare la separazione dei singoli frammenti che vengono letti durante la corsa e non alla sua fine. L'elettroferogramma che si produce contiene le informazioni per ricostruire sequenze fino a 300/1000 coppie di basi.
Figura 1: Schema del sequenziamento con la tecnica Sanger.
I sistemi automatizzati di sequenziamento del DNA
Come abbiamo visto, il processo di automatizzazione del sequenziamento si è evoluto a partire dalla tecnica Sanger. Esso prevede la preventiva frammentazione della sequenza da analizzare mediante l'utilizzo di metodi chimici o fisici. Nel primo caso si utilizzano enzimi di restrizione che tagliano la sequenza in corrispondenza di specifiche zone; nell'altro caso si utilizzano le onde acustiche mediante la tecnica della sonicazione.
I frammenti prodotti, di piccole dimensioni, vengono singolarmente sequenziati e le sequenze ottenute vengono analizzate alla ricerca di corrispondenze sovrapponibili in modo da determinare l'ordine dei nucleotidi sull'intero filamento.
In realtà il procedimento porta sempre alla presenza di buchi indeterminati, detti gap, che vanno riempiti mediante analisi manuale o ricorso alle banche dati circa quella specifica specie. Talvolta,in mancanza di informazioni più specifiche, si ricorre alle informazioni disponibili su specie simili. Per questo motivo, il sistema non è adatto per genomi molto estesi il cui sequenziamento porta alla produzione di numerosi gap e la cui giuntura porta con sé sempre un certo margine di errore.
Pirosequenziamento
Il passo successivo è stato quindi l'avvento del pirosequenziamento, in cui i nucleotidi utilizzati sono marcati ma non mancano del gruppo ossidrile.
I nucleotidi vengono inseriti uno per volta ed emettono una fluorescenza rilevata dal sensore ogni volta che vengono incorporati nel nuovo filamento, mentre sono degradati se non vengono incorporati. La lettura delle fluorescenze in sequenza dà il risultato finale.
Il pirosequenziamento è l'ultima frontiera del sequenziamento essendo rapido, economico, affidabile ed adatto a definire anche sequenze molto lunghe.
Figura 2: gel di sequenziamento del DNA. Le quattro colonne mostrano la posizione relativa delle 4 basi.
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