Esonucleasi
Che cosa sono le esonucleasi?
I termini endonucleasi ed esonucleasi si riferiscono ad enzimi della categoria delle nucleasi. Le nucleasi sono enzimi che tagliano legami fosfodiesterici tra nucleotidi adiacenti in molecole di acido nucleico. Essi sono di grande utilità nelle tecniche di manipolazione del DNA.
Le endonucleasi rompono i legami fosfodiesterici all'interno delle molecole di acido nucleico, mentre le esonucleasi alle estremità, da cui rimuovono uno o più nucleotidi.
L'attività esonucleasica è propria anche di alcune DNA polimerasi e tra le endonucleasi più note si ricordano gli enzimi di restrizione, la cui scoperta negli anni '60 del secolo scorso ha dato avvio alla messa a punto delle tecnologie del DNA ricombinante.
In genere, le nucleasi sono specifiche per il DNA o l'RNA e alcune distinguono tra molecole di DNA a singolo o a doppio filamento e, in quest'ultimo caso, tagliano a livello di uno solo o di entrambi i filamenti. Altre nucleasi sono, invece, molto più versatili.
Schema generale dell'attività delle endonucleasi e delle esonucleasi. Le endonucleasi effettuano dei tagli all'interno delle molecole di acido nucleico generando frammenti di varia lunghezza. Le esonucleasi, agendo sulle estremità degli acidi nucleici, rimuovono da esse uno più nucleotidi.
Esempi di esonucleasi del DNA
Le esonucleasi si distinguono, principalmente, in base alla capacità di rompere i legami fosfodiesterici in modo specifico a partire da una sola estremità o indifferentemente da entrambe le estremità.
L'esonucleasi Bal31, ottenuta dal batterio Alteromonas espejiana, rimuove i nucleotidi da entrambi i filamenti di DNA di una molecola a doppio filamento, agendo su entrambe le estremità. Più a lungo si lascia lavorare e più corti saranno i frammenti ottenuti.
L'esonucleasi III di Escherichia coli, invece, taglia i legami fosfodiesterici solo in corrispondenza dei nucleotidi alle estremità 3'.
Tipi di esonucleasi. L'enzima Bal31 (a) rimuove i nucleotidi da entrambi i filamenti di una molecola di DNA, agendo su entrambe le estremità, mentre l'esonucleasi III (b) rimuove i nucleotidi solo dall'estremità 3' di ogni filamento.
Attività esonucleasica delle DNA polimerasi
Le DNA polimerasi sono enzimi che catalizzano la sintesi di nuovi filamenti di DNA e sono, pertanto, di fondamentale importanza durante la duplicazione del DNA nei batteri e negli eucarioti.
L'attività di polimerizzazione avviene in direzione 5'-3', aggiungendo progressivamente un nuovo nucleotide al terminale 3'-OH di un filamento preesistente, mediante la formazione di un legame fosfodiesterico.
Alcune DNA polimerasi possiedono, oltre all'attività polimerasica, un'attività esonucleasica 3'-5' o 5'-3', a seconda della direzione di rimozione dei nucleotidi.
L'attività esonucleasica 3'-5' è anche detta di correzione di bozze, in quanto consente di rimuovere nucleotidi erroneamente appaiati durante la sintesi dei filamenti nuovi nella duplicazione del DNA. Questa funzionalità si riscontra tanto nelle DNA polimerasi batteriche, quanto in quelle eucariotiche.
L'attività esonucleasica 5'-3' si rinviene, ad esempio, nell'enzima batterico DNA polimerasi I e consiste nella rimozione di un tratto polinucleotidico di un filamento neosintetizzato dall'estremità 5'. Le funzioni principali sono la rimozione dei primer e la riparazione del DNA.
Attività esonucleasica 3'-5 o di correzione di bozze.
L'attività esonucleasica 5'-3' viene ad esempio sfruttata dalla DNA polimerasi I dei batteri per la rimozione dei primer a RNA e la sostituzione con frammenti di DNA. Il nick è un legame fosfodiesterico mancante, formato successivamente dall'enzima DNA ligasi.
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