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Duplicazione del DNA

Come avviene la duplicazione del DNA?

Quando e perché avviene la duplicazione del DNA? Cerchiamo inizialmente di rispondere a questa domanda.

La duplicazione del DNA avviene prima della divisione cellulare sia nelle cellule procariotiche che in quelle eucariotiche.

Nelle cellule eucariotiche la fase del ciclo cellulare dedicata a questo processo è detta fase S. Nelle cellule procariotiche la molecola di DNA viene duplicata quasi contemporaneamente alla divisione cellulare.

La duplicazione del DNA è un requisito essenziale affinché il materiale genetico venga mantenuto stabile e integro nel tempo e nelle diverse popolazioni cellulari di un organismo pluricellulare.

I modelli proposti per spiegare la duplicazione del DNA

Alla fine degli anni ’50 erano stati proposti tre modelli per spiegare la replicazione del DNA.

Nel modello conservativo le eliche della molecola di DNA parentale continuano a rimanere unite dopo la replicazione.

Il modello dispersivo prevede che le eliche delle molecole di DNA ottenute ad ogni ciclo di replicazione contengano tratti di DNA parentale e tratti di DNA di nuova sintesi.

Nel modello semiconservativo ad ogni ciclo di replicazione le molecole d DNA figlie contengono un filamento vecchio e uno nuovo.

modelli proposti per la duplicazione del DNA

I tre modelli proposti per spiegare la duplicazione del DNA

La duplicazione del DNA è semiconservativa

Già nel 1953, quando Watson e Crick annunciarono alla comunità scientifica la scoperta della struttura del DNA, essi stessi postularono che la duplicazione del DNA dovesse avvenire in modo semiconservativo.

Secondo Watson e Crick, la stessa complementarietà delle basi azotate lasciava supporre che le due eliche si separassero per fungere ciascun da stampo per la sintesi di un filamento nuovo.

Solo nel 1958, tuttavia, si ebbe la dimostrazione definitiva del modello di replicazione semiconservativa, grazie all’esperimento di Meselson e Stahl, che scelsero di sfruttare la tecnica della centrifugazione in gradiente di densità con il cloruro di cesio (CsCl) per distinguere molecole di DNA di densità differente a seconda del contenuto in azoto leggero (14N), il più comune, e azoto pesante (15N).

L’esperimento di Meselson e Stahl

Meselson e Stahl procedettero con la dimostrazione della validità del modello di duplicazione semiconservativa, incubando una coltura di Escherichia coli in terreno contenente solo azoto pesante (fornito in forma di cloruro di ammonio).

Dopo una generazione, estrassero il DNA (contenente solo 15N) e lo centrifugarono insieme a cloruro di cesio, constatando che formava un’unica banda.

Successivamente, l’incubazione venne fatta in un terreno contenente esclusivamente 14N.

Il DNA estratto e sottoposto a centrifugazione dopo il primo ciclo di replicazione in presenza di solo azoto leggero, formava un’unica banda, meno densa rispetto alla precedente, lasciando supporre che tutte le molecole di DNA fossero per metà costituite da azoto pesante e per metà da azoto leggero.

Questi risultati consentivano di escludere il modello conservativo (si sarebbero dovute osservare due bande, una corrispondente al DNA parentale, contenente solo azoto pesante, l’altra alle molecole figlie fatte di solo azoto leggero).

Dopo la seconda replicazione comparivano due bande, una corrispondente alla precedente e una di densità minore, corrispondente al DNA con solo 14N.

In quest’ultimo caso si poteva escludere il modello dispersivo, che avrebbe invece portato ad osservare, in seguito a centrifugazione, un’unica banda, di generazione in generazione sempre più leggera per via della progressiva diminuzione del contenuto di azoto pesante.

Dimostrazione della replicazione semiconservativa del DNA, grazie all’esperimento di Meselson e Stahl.

L’assemblaggio della forca di replicazione

La duplicazione della doppia elica di DNA richiede innanzitutto che i due filamenti vengano separati rompendo i legami a idrogeno tra le coppie di basi azotate complementari.

Questo si realizza grazie all’enzima DNA elicasi, che svolgendo da una parte la doppia elica, crea dall’altra un superavvolgimento, rilassato dall’intervento dell’enzima DNA girasi, un tipo di topoisomerasi.

La regione in cui le due eliche sono separate e fungono da stampo per la sintesi di un filamento complementare è detta forca (o forcella) di replicazione.

L’avanzamento della forcella lungo la doppia elica è mediato dal movimento dell’elicasi.

Le proteine SSB (single strand binding proteins, proteine di legame di filamenti singoli) si legano a ciascuna elica, proteggendole e impedendo la formazione di tratti a doppio filamento che potrebbero ostacolare l’avanzamento della forca di replicazione.

Gli elementi indispensabili all’avvio della duplicazione di DNA: DNA elicasi, DNA topoisomerasi, proteine SSB. La zona in cui i due filamenti di DNA sono separati è detto forca di replicazione.

L’origine di replicazione del DNA

Sia nei procarioti che negli eucarioti, l’assemblaggio della forca di replicazione avviene a partire da una regione specifica del DNA, detta origine di replicazione.

In un procariote tipico, come Escherichia coli, in cui il DNA è organizzato in un’unica molecola circolare, l’origine di replicazione è unica ed è chiamata oriC.

In essa si assemblano due forche di replicazione che procedono in direzione opposta, fino a incontrarsi in una regione pressoché opposta a oriC, detta sito di terminazione (terC) in cui l’incontro delle due forcelle segnala la fine della duplicazione del DNA.

Al termine della replicazione le due molecole figlie di DNA si presentano unite come gli anelli di una catena, per poi essere separate grazie all’intervento di una particolare topoisomerasi.

Il processo di duplicazione del DNA batterico dura all’incirca 40 minuti.

Schema generico della duplicazione del DNA batterico.

Il genoma eucariotico è notevolmente più grande rispetto a quello procariotico e richiederebbe circa tre settimane per essere replicato completamente se il processo iniziasse a partire da una sola origine.

Il DNA eucariotico viene invece duplicato in poche ore perché esistono più origini di replicazione.

Anche in questo caso, in ogni origine vengono organizzate due forche che procedono in direzione opposta.

duplicazione del DNA eucariotico

Le maggiori dimensioni del DNA eucariotico impongono la presenza di più origini di replicazione.

La reazione di polimerizzazione del DNA

La sintesi del filamento nuovo avviene ad opera dell’enzima DNA polimerasi che, tuttavia, non è in grado di iniziare la sintesi di una nuova catena, ma di allungare in direzione 5’-3’ un tratto di DNA preesistente.

A questo scopo, una volta avvenuta la separazione delle due eliche, l’enzima primasi (una RNA polimerasi) crea un piccolo tratto di RNA, detto primer o innesco, che viene allungato dalla DNA polimerasi mediante l’aggiunta di deossinucleotidi, rispettando la complementarietà delle basi azotate rispetto a quelle dello stampo.

La DNA polimerasi ha bisogno di primer per poter sintetizzare un nuovo filamento. B) I nucleotidi sono aggiunti dalla DNA polimerasi in direzione 5’-3’.

I substrati della DNA polimerasi

La DNA polimerasi utilizza nucleosidi trifosfati (dNTP, deossinucleosidi trifosfato).

Il rilascio di pirofosfato (PPi) e la successiva idrolisi in due gruppi fosfato liberi, in seguito alla formazione del legame fosfodiesterico con il terminale 3’-OH dell’ultimo nucleotide della catena in crescita, consente di rilasciare l’energia indispensabile alla reazione di polimerizzazione.

La DNA polimerasi è in grado di rilevare appaiamenti non corretti e di rimuovere i nucleotidi errati grazie a un’attività esonucleasica 3’-5’, definita anche correttore di bozze (proofreading).

Il termine esonucleasi si riferisce al fatto che la rimozione dei nucleotidi avviene a partire da un’estremità, nel caso dell’attività proofreading dall’estremità 3’, mentre se le nucleasi tagliano i filamenti centralmente sono dette endonucleasi.

La sintesi di un nuovo filamento di DNA avviene rispettando la complementarietà delle basi azotate rispetto allo stampo e utilizzando deossinucleosidi trifosfato. Il rilascio e l’idrolisi di pirofosfato rilascia l’energia necessaria alla reazione di polimerizazione.

La diversa sintesi dei due filamenti di DNA

La DNA polimerasi crea un filamento nuovo procedendo in direzione 5’-3’, ma le due eliche di DNA hanno orientamento opposto e ciò pone il problema di come i due filamenti vengano sintetizzati contemporaneamente seguendo l’avanzamento della forca di replicazione.

Mediante esperimenti condotti negli anni ’60 è stato scoperto che uno dei due filamenti viene sintetizzato in modo continuo (leading strand, filamento continuo) a partire da un unico primer, l’altro in modo discontinuo (lagging strand, filamento ritardato).

La sintesi del filamento lagging avviene a tratti, producendo dei frammenti di DNA, detti frammenti di Okazaki, lunghi 1000-2000 nucleotidi nei procarioti, 100-200 negli eucarioti.

Ogni frammento viene sintetizzato da un primer e la sintesi si arresta in corrispondenza del terminale 5’ di un frammento precedente.

Tutti i primer vengono rimossi nel corso della duplicazione dei due filamenti ad opera dell’enzima RNAasi H e dall’intervento di polimerasi alternative che provvedono inoltre a colmare i vuoti rimasti.

La formazione dei legami fosfodiesterici tra i vari frammenti è realizzato dalla DNA ligasi.

schema della duplicazione del dNA

Schema esemplificativo della duplicazione del DNA. Il filamento duplicato in modo continuo è detto leading strand, quello prodotto in modo frammentario è detto lagging strand.

Il ripiegamento del filamento lagging e dello stampo

La sintesi del filamento lagging richiede che venga ripiegato insieme allo stampo a formare un’ansa che si allunga man mano che la sintesi procede.

Questo meccanismo consente ai due filamenti di essere replicati quasi contemporaneamente, assecondando il movimento della forca di replicazione lungo la doppia elica.

Ogni filamento è sintetizzato da una propria polimerasi e sia nei procarioti che negli eucarioti sono note diverse polimerasi.

In Escherichia coli la polimerasi principalmente coinvolta è la DNA polimerasi III, di cui esistono due copie unite a formare un complesso multiproteico insieme ad altre proteine, saldamente ancorato alla forca di replicazione.

Negli eucarioti intervengono, invece, due copie della DNA polimerasi δ, che tuttavia non sono fisicamente unite.

meccanismo messo in atto per la sintesi del filamento lagging in Escherichia coli

Il probabile meccanismo messo in atto per la sintesi del filamento lagging in Escherichia coli.

La duplicazione delle estremità dei cromosomi lineari

La forma lineare dei cromosomi eucariotici pone dei limiti alla replicazione delle estremità.

Il problema riguarda il filamento lagging, dove la rimozione dell’ultimo primer del frammento di Okazaki sintetizzato per ultimo non consente al macchinario replicativo di colmare il gap lasciato, perché dovrebbe agire allungando un terminale 3’ di un frammento adiacente.

Il risultato sarebbe un filamento lagging più corto che si accorcerebbe ad ogni replicazione potendo causare la perdita di geni essenziali.

Le estremità dei cromosomi, i telomeri, svolgono un ruolo protettivo di fondamentale importanza dei cromosomi e il loro mantenimento deve essere salvaguardato.

Essi sono caratterizzati, in una delle due eliche, dalla ripetizione per un centinaio di volte di corte sequenze 5’-TTAGGG-3’.

Tali sequenze non hanno alcun ruolo codificante, ma l’associazione con proteine specifiche forma dei “cappucci” alle estremità dei cromosomi con l’importante funzione di proteggere il DNA dall’attacco di vari enzimi.

Il mantenimento dei telomeri è assicurato dall’enzima telomerasi, che contiene un RNA ricco in nucleotidi AC in grado di appaiarsi all’estremità del cromosoma ricca in TG, facendone sporgere una parte che la componente proteica dell’enzima allunga sulla base della sequenza dell’RNA, utilizzata quindi come stampo.

L’allungamento della porzione ricca in TG crea un tratto a singolo filamento.

È probabile che il filamento complementare venga allungato grazie all’intervento del normale macchinario replicativo.

telomerasi

La componente proteica della telomerasi allunga il filamento ricco in TG utilizzando lo stampo di RNA. La telomerasi quindi trasloca consentendo l’allungamento di un altro tratto. Il processo continua per più volte.

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