Colorazione di Gram
Che cosa è la colorazione di Gram?
La colorazione di Gram è una tecnica di laboratorio tra le più conosciute e diffuse che permette di effettuare una veloce classificazione dei batteri in due categorie: Gram positivi e Gram negativi.
Questa classificazione, che si basa sulla diversa risposta che gli appartenenti alle due categorie manifestano dopo essere stati sottoposti alla colorazione di Gram, non ha alcun valore tassonomico ma permette di stabilire la natura della parete cellulare e quindi di interagire con i batteri attraverso i prodotti e i protocolli più appropriati.
Le differenze nella composizione della parete cellulare dei batteri, infatti, determinano una diversa risposta a trattamenti antibiotici e a manipolazioni di laboratorio.
Figura 1: I batteri Gram positivi risultano viola dopo la colorazione di Gram ,quelli Gram negativi invece appaiono rosa.
Differenza nella parete cellulare tra batteri Gram negativi e Batteri Gram positivi
Iniziamo con l'esaminare quali sono le differenze nella parete cellulare di queste due categorie di batteri, in modo da comprendere il motivo della diversa risposta alla colorazione di Gram.
La parete dei batteri Gram positivi è molto spessa ed è composta per il 90 per cento da peptidoglicano, una complessa molecola formata da catene di polimeri contenenti acido N-acetil-muramico e N-acetil-glucosammina, alternati in strati e tenuti insieme da catene peptidiche che formano legami crociati tra gli strati di peptidoglicano.
Figura 1: struttura generale del peptidoglicano.
Il peptidoglicano, in questi batteri, rappresenta anche la barriera più esterna della cellula. Nei batteri Gram negativi, invece, la parete cellulare è sottile e il peptidoglicano ne rappresenta solo il 20 per cento.
Inoltre, cosa più importante, esternamente alla parete di peptidoglicano esiste una ulteriore membrana cellulare, simile per composizione a quella citoplasmatica.
La membrana esterna dei batteri Gram negativi è infatti composta da fosfolipidi organizzati in un doppio strato, proprio come in tutte le membrane cellulari, ed è attrezzata con la presenza di tre tipi di molecole accessorie:
- proteine transmembrana: le proteine transmembrana sono necessarie per il passaggio di molecole idrofile tra l'interno e l'esterno della cellula. La natura idrofila di queste molecole, infatti, gli impedisce di diffondere direttamente attraverso i lipidi e quindi necessitano di "canali" dedicati che ne consentano il trasporto.
- Lipoproteine e lipopolisaccaridi: oltre alle proteine viste in precedenza, esistono altre due classi di molecole che condividono in parte la natura lipidica della membrana, presentando poi alle estremità delle molecole di natura differente: se sono di natura glucidica, si parla di lipopolisaccaridi, se di natura proteica si definiscono lipoproteine. Queste ultime hanno la funzione di legare lo strato esterno di peptidoglicano permettendo una maggiore aderenza della membrana alla parete cellulare. I lipopolisaccaridi, come vedremo, hanno un ruolo determinante nella risposta della cellula alla colorazione di Gram
Figura 2: differenze nella parete dei batteri Gram Positivi (sx) e Gram negativi (dx).
Preparazione del campione per la colorazione di Gram
Prima di procedere alla colorazione vera e propria, il campione batterico deve essere preparato nella maniera corretta. La prima procedura è quella di isolare una colonia, per evitare di esaminare un mix di batteri differenti o una colonia non omogenea. Per ottenere l'isolamento, nel caso di batteri in terreno liquido, si eseguono una serie di diluizioni successive in terreno di coltura fino ad isolare la singola cellula batterica.
Una volta isolata la colonia e lasciata crescere a sufficienza, si prepara il vetrino distribuendoci uniformemente la colonia (si dice che la colonia viene "stemperata") utilizzando soluzione fisiologica. Una volta asciugato, il vetrino è pronto per essere colorato. Talvolta si può anche procedere al fissaggio della colonia mediante calore.
Colorazione con Cristal-Violetto
Il primo passaggio vero e proprio della Colorazione di Gram è l'utilizzo del Crital-Violetto, un colorante che viene inglobato dal peptidoglicano di entrambi i tipi di batteri. Questo passaggio prevede che il campione resti a contatto con il colorante per circa 5 minuti, dopo di che si passa alla prima fase di lavaggio.
Lavaggio in soluzione di Lugol
In questa fase il campione viene sottoposto ad una procedura che serve a rafforzare il legame tra il colorante e la parete cellulare. A tale scopo si utilizza una soluzione di iodio e ioduro di potassio nota come Lugol, che per l'azione che ha sul colorante prende il nome di sostanza Mordente o Condensante.
Decolorazione dal Cristal-Violetto
Questa fase rappresenta il vero spartiacque tra i Batteri Gram positivi e quelli Gram negativi. Dopo questo passaggio, infatti, i Gram positivi risultano ancora colorati con il Cristal-Violetto, mentre i Gram negativi perdono la colorazione. La decolorazione può essere fatta utilizzano acetone, che scioglie i lipopolisaccaridi della membrana permettendo la fuoriuscita del colorante, oppure con etanolo al 100% .
L'etanolo agisce disidratando la parete di peptidoglicano. Nei batteri Gram positivi, dove la parete è particolarmente spessa, la disidratazione e la conseguente restrizione della parete ha l'effetto di serrarla ermeticamente, rendendo impossibile la fuoriuscita del colorante. Nei batteri Gram negativi, invece, la natura sottile della parete rende inefficace questo passaggio, permettendo al colorante di fluire via.
Colorazione di contrasto
L'ultimo passaggio della colorazione di Gram è l'utilizzo di un secondo colorante, la Safranina, che è detto colorante di contrasto perché permette di differenziare i batteri Gram positivi da quelli Gram negativi.
La Safranina agisce in questo caso solo sui batteri Gram negativi, che non sono più colorati, rendendoli rosa, in contrasto con la colorazione viola che ancora accompagna i batteri Gram positivi.
Figura 3: Fasi della colorazione di Gram.
Analisi si al microscopio
Una volta terminata la procedura di colorazione, i vetrini possono essere osservati al microscopio dove risulterà evidente la differenza tra i batteri che hanno mantenuto la colorazione viola del colorante primario e quelli che invece hanno acquisito la colorazione di contrasto, ossia i batteri Gram negativi.
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