Preparato istologico
Allestimento di un preparato istologico
Per poter osservare al microscopio ottico un organo o una sua parte, questo deve essere fissato, incluso in un mezzo solido e quindi sezionato in fettine molto sottili, che vengono colorate in modo da evidenziarne le diverse parti.
1) Fissazione
La fissazione ha lo scopo di uccidere il più rapidamente possibile le cellule, impedendone quindi l'autolisi: in tal modo se ne impedisce la alterazione post-mortem, causata dall'azione degli enzimi autolitici.
La fissazione consiste nel trattamento del campione di tessuto, con procedimenti chimici (formalina, ecc.) e/o fisici (freddo intenso o il calore).
2) Disidratazione
La disidratazione serve ad allontanare l'acqua presente nel campione affinché possa essere incluso in un mezzo che, solidificando, ne permetta il taglio in fettine sottili.
Solitamente, la disidratazione viene ottenuta con etanolo a concentrazioni crescenti.
È da sottolineare come l'uso dell'alcool asporti i lipidi presenti nel campione: caratteristico sarà così l'aspetto delle cellule adipose (per esempio), che appariranno come sferule vuote, perfettamente trasparenti.
3) Immersione in paraffina
Ultimata la disidratazione, il campione viene immerso, a caldo, in paraffina liquida e lasciato permeare perfettamente dalla stessa.
Dopo la solidificazione, il blocchetto così ottenuto potrà essere lavorato al microtomo, uno strumento provvisto di una affilatissima lama, che consente di realizzare sezioni molto sottili del campione.
Le sezioni, dello spessore voluto, fino a 1 µm (µm = micrometro), raccolte sopra un vetrino porta-oggetto vengono "sparaffinate" (ovvero, con passaggi successivi in xilolo e etanolo viene asportato il mezzo di inclusione) e, quindi, colorate.
4) Colorazione
La colorazione ha il compito di creare, in seno al campione, un "contrasto interno" altrimenti inesistente; coloranti diversi, legandosi ai vari componenti cellulari o tissutali, ne modificano selettivamente il comportamento nei confronti della luce passante, rendendoli facilmente distinguibili l'uno dall'altro.
Le sezioni istologiche vengono di solito colorate con sostanze nella cui molecola sono presenti radicali acidi e/o basici i quali intervengono nel meccanismo cromogeno. Di solito, le sostanze basiche del tessuto attraggono i radicali acidi dei coloranti, mentre le sostanze acide mostreranno affinità per i radicali basici. Si parla così di acidofilia e basofilia dei componenti del tessuto o della cellula.
I coloranti possono essere sia acidi che basici: quelli acidi (eosina, acido picrico) colorano i componenti basici sia cellulari (citoplasma) che tissutali (tessuto osseo, tessuto connettivo), mentre quelli basici (ematossilina, fucsina basica) colorano le strutture acide presenti sia nelle cellule (nucleo, ribosomi, ecc.) che nei tessuti (ad esempio: cartilagine).
5) Montaggio
Al termine della colorazione si effettua il montaggio che consente di conservare a lungo il preparato per eventuali future osservazioni: sulla fettina asciutta viene posta una goccia di un mezzo di montaggio (solitamente balsamo del Canada, che è una resina adesiva) e su questa un sottilissimo vetrino copri-oggetto.
Con la solidificazione del mezzo, il preparato istologico, ora permanente, è pronto per l'osservazione al microscopio.
Esame istologico
Il primo momento dell'esame istologico consta nell'osservazione, a occhio nudo e contro luce, della sezione. Si ottengono, così, alcune informazioni importanti quali:
- il profilo della sezione, la sua compattezza oppure la presenza di spazi sono indicativi dell'organizzazione strutturale tipica di un organo pieno (parenchimatoso), di un organo cavo o di altro tipo;
- l'uniformità della colorazione o la presenza di aree di diverso colore o intensità possono essere indicative della presenza di un tipo di tessuto piuttosto che di un altro.
Macchie di colore bluastro potrebbero far pensare ad addensamenti di tessuto linfoide; zone colorate scarsamente o trasparenti, alla presenza di tessuto adiposo, e così via.
Il secondo momento dell'esame istologico è riservato all'osservazione microscopica: sistemato il vetrino sul tavolino porta-preparati, ed effettuate le opportune regolazioni dello strumento, si esamina l'intera sezione con un obiettivo a piccolo ingrandimento (per esempio 10x). Con ciò si ha un'idea generale del preparato, e inoltre si può individuare la porzione più favorevole per l'esame a ingrandimenti maggiori.
L'esame a piccolo ingrandimento rivela se il campione è formato da tessuti diversi, quali sono i loro rapporti reciproci, le eventuali differenze più manifeste. Si può anche cercare di identificare la presenza o meno di sostanze fondamentali, la distribuzione delle cellule, i loro rapporti, la loro forma, oltre a quella dei relativi nuclei.
Un ingrandimento ulteriore (per esempio 25x) chiarirà dettagli prima rimasti indistinti, come i tipi cellulari, la posizione dei nuclei cellulari, l'orientamento delle strutture tissutali rispetto al piano della sezione, le strutture organizzate dalle cellule (come tubuli, nidi, strati, ecc.), raggruppamenti più o meno regolari; si riconosceranno con precisione i vasi sanguigni e i loro rapporti con il tessuto circostante, le strutture nervose, i fasci muscolari.
A ingrandimento ancora maggiore (per esempio 40x) si potranno riconoscere tipiche strutture cellulari, come alcune specializzazioni della membrana cellulare, oltre a distinguere con esattezza i tipi cellulari di dimensioni più ridotte, come quelli rinvenibili nel midollo osseo o nell'ipofisi.
Durante l'osservazione di un campione istologico, può risultare utile avere sempre presenti le dimensioni delle strutture inquadrate, man mano che ne si modifica l'ingrandimento. Nella pratica è utile fare riferimento al diametro dei globuli rossi che, nell'uomo, si aggira intorno ai 7,5 µm. Poiché è improbabile che il tessuto o l'organo in esame sia sprovvisto di vasi sanguigni, e che questi risultino privi di globuli rossi, è sempre possibile, per confronto diretto "sul campo", risalire alle dimensioni delle strutture che interessano.
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